Detección de TNFα en plasma por ELISA y citometría: una comparación en dengue

Abstract

El dengue es la enfermedad viral más importante transmitida por vectores y las citoquinas (CTS) han demostrado ser importantes en su fisiopatología.Particularmente, la infección del dengue incrementa los niveles de TNF-a en plasma, y en algunos casos se ha propuesto una asociación entre los niveles de esta citocina y la severidad clínica. Debido a que el TNF-α es una CT crítica en la inmunidad contra el dengue, es fundamental su eficiente y precisa detección. A través del ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA, kit DuoSet R & D) y citometría basada en microesferas (CBA, Kit inflamatoria, BD), se compararon los niveles de TNF-α en muestras pareadas de plasma y suero de 33 sanos y 76 niños con dengue confirmado. Además, también se realizaron ensayos de porcentaje de recuperación de las concentraciones de TNF-α utilizando TNF-α recombinante humano y soluciones estériles (RPMI 1640 y PBS, ambos de Gibco, como controles negativos). En soluciones estériles, los niveles de TNF-α evaluados por ELISA y CBA correlacionaron positivamente (r = 0,72, P <0,0001, prueba de Pearson). Sin embargo, en plasma, la tasa de detección de TNF-α fue significativamente mayor por ELISA (P <0,0001, test de Fisher). En comparación con los controles sanos, los niveles de TNF-α fueron significativamente más altos en el suero que en plasma de los niños infectados de dengue (p = 0,03, prueba de Wilcoxon), lo que sugiere que el suero es más eficiente que el plasma para la medición de este CT. Los porcentajes de recuperación de TNF-α fueron mucho más bajos en el plasma que en medio de cultivo (p≤0.01, prueba de Mann-Whitney), pero fue igualmente bajo en el plasma de sanos vs dengue (P = 0,2, prueba de Mann-Whitney), lo que indica que el efecto es independientemente de la enfermedad. Dos diluciones seriadas de plasma de niños sanos y con dengue (con y sin adición de TNF-α recombinante) se llevaron a cabo, y el porcentaje de recuperación más alto se obtuvo cuando se diluyeron las muestras con concentraciones elevadas de TNF-α (P = 0,008, prueba de Friedman), pero no en las muestras no diluidas de niños con dengue o cuando las bajas concentraciones de TNF-α recombinante fueron añadidas (P≥0.1, test de Friedman). En resumen, se encontró una diferencia en la eficiencia en la detección de TNF-α,y esto se explica en parte por el tipo de muestra. Por lo tanto, la evaluación adecuada del TNF-α en plasma ha demostrado ser aun un desafío.